Примерное время на чтение статьи: 34 минуты

2. Молекулярная генетика.

2.1. Методы  и  задачи  молекулярной генетики.

 Молекулярная генетика изучает молекулярные основы наслед­ственности и изменчивости. Основное положение молекулярной генетики связано с признанием ведущей роли нуклеиновых кислот как хранителей и переносчиков генетической информации, опреде­ляющей первичную структуру белков клетки.

  2.2.           Классификация генов.

Ген-единица наследственности и изменчивости. По современным  данным  ген— это участок  молекулы ДНК,  дающий  информацию  о  синтезе  определённого  полипептида  или  нуклеиновой кислоты.

Набор  генов  организма, которые  он  получает  от  своих  родителей называется  генотипом, а  содержание генов в гаплоидном наборе хромосом- геномом.

Совокупность  всех  внешних  и  внутренних признаков организма, развивающихся  на  основе  генотипа  под воздействием  факторов  внешней среды называется  фенотипом, а отдельный признак, определяемый одним геном— феном. 

Проблема гена — центральная проблема молекулярной генети­ки. Она берет свое начало с работы Т. Моргана «Теория гена» (1926), в которой ген был представлен как неделимая единица му­тации (ген изменяется как целое), рекомбинации (кроссинговер про­исходит в пределах гена) и функции (все мутации одного гена связа­ны с одной функцией).

С тех пор представления о гене радикально изменились. Важ­ным этапом в развитии теории гена были работы С. Бензера в конце 1950-х гг. (Benzer, 1961). Они показали, что ген, представляющий собой нуклеотидную последовательность, не является неделимой единицей рекомбинации и мутации. Генетические исследования бактерий и фагов, благодаря гигантской численности их потомства, позволили уловить ничтожные доли (= 0,0001 %) внутригенных рекомбинаций, что подтверждало принцип дробимости гена. Еди­ницу рекомбинации С. Бензер назвал реконом, а единицу мута­ции — мутоном. В дальнейшем было показано, что мутон и рекон соответствуют одной паре нуклеотидов. Единица генетической фун­кции, которую С. Бензер назвал цистроном, совпадает с понятием «ген» (иногда термин «цистрон» еще употребляется в генетике как понятия гена, когда хотят подчеркнуть его функциональное значение).

Современная теория гена сформировалась в русле нового направления, которое Дж. Уотсон назвал молекулярная биология.

Все гены по функциям подразделяются на структур­ные и функциональные.

Структурные гены несут инфор­мацию о белках-ферментах и гистонах, о последователь­ности нуклеотидов в различных видах РНК.

Среди фун­кциональных генов выделяют:

• гены-модуляторы, усили­вающие или ослабляющие действие структурных генов (ингибиторы, интенсификаторы, интеграторы, модифи­каторы;
• гены, регулирующие работу структурных ге­нов (регуляторы и операторы).

Известно, что генотип у всех соматических клеток оди­наковый (следствие равного распределения генетического материала между дочерними клетками при митозе), од­нако клетки разных тканей и органов одного организма сильно отличаются (нервные, мышечные, эпителиальные, соединительнотканные). Следует предположить, что в разных клетках работают разные блоки генов. Область проявления действия данного гена называется поле дей­ствия гена, например, гены детерминирующие рост во­лос, развитие определенных папиллярных узоров на паль­цах, ладонях и стопах и др.

Гены функционируют непостоянно. Например, гены, детерминирующие синтез пигмента меланина, окрашива­ющего волосы человека, в пожилом возрасте перестают работать, и волосы седеют. Гены, детерминирующие син­тез половых гормонов, интенсивно начинают функциони­ровать с момента полового созревания. Их функция зна­чительно снижается к старости. Время работы гена — это период его функционирования.

2.3. Структура гена прокариот

   Главная особенность организации генома прокариот — это их объединение в группы, или кластеры. Все сцепленные гены кластера кодируют ферменты одного биосинтетического пути и трансрибируются на общую молекулу м-РНК. Такая м-РНК называете и полицистронной. Группа структурных генов прокариот, находящихся под контролем одного регуляторного участка, называется опероном (Miller, Reznikoff, 1978).

Организация по типу оперона позволяет бактериям быстро переключать метаболизм с одного субстрата на другой. Бактерии не синтезируют ферменты определенного метаболического пути в отсутствие необходимого субстрата, но способны в любой момент начать их синтез при появлении этого субстрата.

Только некоторые гены бактерий транскрибируются индивидуально.  Их м-РНК называется моноцистронной. Большинство генов бактерий представлены непрерывными участками ДНК, вся информация которой используется при синтезе полипептида. Между генами прокариот могут располагаться межгенные участки — спейсеры. Внутри оперона спейсеров не бывает.

2.4. Структура гена эукариот

В геноме эукариот выделяют три типа последовательностей ДНК:

• Это уникальные последовательности, представленные одной или несколькими копиями (60-80 % генома);
• умеренные повторы, представленные от десятка до нескольких тысяч копий на геном (10-20 % генома);
• высокоповторяющаяся ДНК, представленная от нескольких тысяч до миллиона копий на геном (10-20 % генома).

    Наличие повторяющихся последовательностей ДНК, т. е. при­сутствующих в количестве нескольких копий, является удивитель­ной особенностью генома эукариот.

Большинство функционирующих генов являются уникальными последовательностями, некоторые представлены умеренными пов­торами. Высокоповторная ДНК представлена обычно очень корот­кими последовательностями (около 300 п. н.). Она, вероятно, игра­ет структурную или регуляторную роль и локализована в основном в прицентромерном гетерохроматине.

Сенсационным открытием явилась показанная в 1977 г. Р. Робертсом и Ф. Шарпом прерывистая, «мозаичная», экзон-интронная структура большинства эукариотических генов (Brown, 1981).

Экзоны  — участки гена, кодирующие структуру полипептида,

интроны — участки гена, не кодирующие структуру полипептида. Количество интрон-экзонных переходов в пределах гена может варьировать от 0 до 50. Колебание размеров более характерно для интронов (от 20 до более чем 10 000 п. н.). Термины «экзон» и «интрон» были предложены У. Гилбертом (Gilbert, 1981).

Для некоторых эукариотических генов экзоны составляют лишь незначительную часть их длины. Роль интронов до конца не ясна, возможно они участвуют в процессах генетической рекомбинации, же в процессах регуляции экспрессии.

Дальнейшие исследования в сфере молекулярной биологии еще не  четкость определения понятия «ген». В геноме эукариот были обнаружены обширные регуляторные области. Проблема осложняется тем, что регуляторные области могут лежать за пределами единиц транскрипции на расстоянии в десятки тысяч п. н. регуляторной части генома выделяют различные участки. 

Промотор — участок  связывания с ДНК факторов транскрипции, образования комплекса ДНК-РНК-полимера-зы для  запуска  синтеза РНК.

Энхансеры — усилители транскрипции.

Сайленсеры — ослабители транскрипции.

Между энхансерами и сайленсерами нет четкого «разделения», поскольку обычно они взаимодействуют со многими генами. а та же последовательность ДНК может выступать и в роли энхансерара, и в роли сайленсера в зависимости от типа клеток. Эти послндовательности   представляют   собой   короткие   участки   ДНК (100—200 п. н.), являющиеся местом прикрепления регуляторных белков. Каждый энхансер или сайленсер может взаимодействовать с целым рядом регуляторных белков. Это изменяет активность генов путем изменения конформации определенного участка ДНК.

Инсуляторы — короткие последовательности (300—1000 п. н.), обеспечивающие относительную независимость функций гена, блокируя взаимодействие между энхансером и промотором.

Рис.  Структура эукариотического гена:

1 — энхансеры; 2 — сайленсеры; 3 — промотор; 4 — экзоны; 5 — интроны;

6 — участ­ки экзонов, кодирующие нетранслируемые области

лях инсуляторам  отводится  важная роль, во многом определяющая функционирование домена, который, вероятно, представляет собой единую функциональную единицу, возможно один ген.

Между генами существуют особые межгенные последовательно­сти — спейсеры.

Структуру эукариотического гена, включающую транскрибируе­мые и регуляторные области, можно представить следующим обра­зом (рис.).

         Нетранслируемые области выполняют регуляторную роль в про­цессе трансляции.

Таким образом, используя термин «ген» для обозначения после­довательности ДНК, ответственной за синтез одного белка, мы те­перь вкладываем в него возможность прерывистой структурной ор­ганизации, возможность вхождения части данной последовательно­сти в состав другого гена, неоднозначность экспрессии этого участка.

2.5. Регуляция работы генов.

Многими учеными было замечено, что некоторые фер­менты у дрожжей и бактерий образуются в клетках только на определенных питательных средах. Например, при выращивании кишечной палоч­ки на питательной среде, не содержащей лактозы, ее клетки содержат незначительное число (меньше пяти) молекул фермента лактазы, разлагающего лактозу на глюкозу и галактозу. При добавлении в питательную среду лактозы бактериальные клетки в течение 2-3 мин синтезируют большое количество лактазы (свыше 5 тыс. молекул). При удалении из среды лактозы синтез лактазы быстро прекращается. Вещества, индуцирующие синтез ферментов, которые их разлагают, называются индукторами (в данном примере индуктором является лактоза).

Подобные механизмы используются клеткой для вык­лючения синтеза нужных ей соединений при их наличии в питательной среде. Например, аминокислота трипто­фан синтезируется при участии фермента триптофансинтетазы. Однако, если в среде, на которой выращиваются бактерии, присутствует триптофан, синтез фермента не­медленно прекращается. Это явление получило название репрессии, а вызывающий его фактор (в нашем приме­ре — триптофан) — корепрессором.

  2.5.1. Регуляция работы генов у прокариот.

Схема регуляции транскрипции у прокариот была предложена Ф. Жакобом и Ж. Моно в 1961 г на примере лактозного оперона. Группа структурных генов, управляемая од­ним геном-оператором, образует оперон. В состав опе­рона входит также небольшой участок ДНК — промо­тор с инициатором — место первичного прикрепления РНК-полимеразы — фермента, катализирующего реак­ции ДНК-зависимого синтеза и-РНК. Ген-оператор вклю­чает и выключает структурные гены для считывания информации, следовательно, они активны непостоянно. Заканчивается оперон терминатором. Ген-регулятор, находящийся обычно на некотором расстоянии от опе­рона, постоянно активен и на основе его информации синтезируется особый белок-репрессор. Белок-репрессор  обладает    способностью блокировать ген-оператор, всту­пая с ним в химическое соединение, и тогда считывание информации со структурных генов не происходит, т.е. оперон «не работает».   (рис.)          

Если в клетку поступает индуктор, то он связывает белок-репрессор (вступает с ним в химическую связь), освобождая ген-оператор. РНК-полимераза разрывает связи между двумя цепочками ДНК оперона, начиная с промотора, и по принципу комплементарности инфор­мация (порядок нуклеоти-дов) со структурных генов пе­реписывается на и-РНК (полицистронную), которая за­тем идет в рибосомы, где синтезируются ферменты, раз­лагающие индуктор. Когда последние молекулы индук­тора будут разрушены, освобождается белок-репрессор, который снова блокирует ген-оператор — работа  оперо­на  прекращается. Она опять возобновится при поступ­лении индуктора.

                                                                                      Рис. Схема  регуляции  транскрипции  у  прокариот.   (Оперон  «работает»).

Для каждого оперона имеется свой специфический ин­дуктор. Например, для лактозного оперона индуктором является лактоза, для фруктозного — фруктоза и т.п.

2.5.2. Регуляция работы генов у эукариот.

Схема ре­гуляции транскрипции у эукариот разработана Г. П. Георгиевым (1972). Принцип регуляции (обрат­ная связь) сохраняется, но механизмы ее более слож­ные. Единица транскрипции у эукариот называется транскриптоном.   Он состоит из неинформативной (ак­цепторной) и информативной (структурной) зон.

      Не­информативная зона начинается промотором с ини­циатором. Далее следуют группа генов-операторов, за которыми расположена информативная зона. Инфор­мативная зона образована структурным геном, разде­ленным на экзоны (информативные участки) и интроны. (неинформативные участки). Заканчивается   транс­криптон терминатором.

    2.6. Механизмы реализации генетической информации. 

     Генетическая информация, записанная в виде определенной последовательности нук­леотидов молекулы ДНК, обеспечивает синтез опреде­ленного белка-фермента, который катализирует тече­ние соответствующей биохимической реакции, в резуль­тате чего проявляется признак. Геномный уровень орга­низации генетического материала обеспечивает взаимо­действие аллельных и неаллельных генов. Следователь­но, проявление действия конкретного гена зависит от других генов. Они могут влиять непосредственно на данный ген через взаимодействие белков-ферментов, кодируемых этими генами, изменять течение биохимичес­ких реакций и, тем самым, влиять на проявление дан­ного признака. В свою очередь данный ген может вли­ять на реализацию действия других генов. На реализа­цию действия гена влияют факторы внешней среды, которые могут изменять структуру молекул ДНК, и-РНК, белков-ферментов, течение биохимических реак­ций и, следовательно, — фенотипические проявления

генов.

Механизм дифференцировки стволовых клеток мож­но представить следующим образом. Недифференциро­ванные клетки имеют разный химический состав цитоп­лазмы, то есть разные индукторы, которые включают в работу разные блоки генов (транскриптоны), что при­водит к синтезу разных белков-ферментов. Разные фер­менты катализируют различные биохимические реакции. Таким образом в разных клетках идет синтез разных типо- и тканеспецифических белков, вследствие чего об­разуются разные типы клеток, т. е. постепенно хими­ческая разнородность цитоплазмы клеток переходит в морфологические отличия.

Условно гены можно разделить на три группы:

а) функционирующие во всех клетках (например, гены, кодирующие ферменты энергетического обмена);

б) функционирующие в клетках одной ткани (например, гены, детерминирующие синтез миозина в мышечной ткани);

 в) специфичные для одного типа клеток (например, гены  гемоглобина в незрелых эритроцитах). Таким образом, главный механизм дифференцировки клеток — блокировка и деблокировка транскриптонов на определенных этапах развития клеток.

2.7.  Получение генов.  

Генная инженерия — это совокупность методов получения генов и переноса генетической информации из одних организмов в дру­гие. В самом общем виде генно-инженерный процесс представляет собой различные операции над рекомбинантными ДНК, т. е. моле­кулами, объеди-няющими ДНК разных видов (Уотсон и др., 1986). Несмотря на разнообразие используемых подходов, в этом процессе мы можем выделить определенную последовательность этапов.

     2.7.1. Выделение генов

Возможно использование нескольких путей выделения генов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.

• Химический синтез генов

Синтез нуклеотидов с заданной последовательностью, соответ­ствующей одному гену, впервые был осуществлен в лаборатории Г. Кораны в 1969 г. (Agarwal et al., 1970). Это был ген аланиновой т-РНК дрожжей размером в 77 п. н. Еще более значительным собы­тием был искусственный синтез гена тирозиновой т-РНК, прове­денный тем же исследователем в 1976 г. Этот ген включал области промотора и терминатора, а главное — он был биологически акти­вен, т. е. работал при введении в клетку.

Уже в 1980-е годы были успешно синтезированы функциональ­но активные гены инсулина, сомато-статина, интерферона. Про­гресс в этой области позволил разработать специальные автоматы для синтеза ДНК определенной последовательности.

• Выделение отдельных генов из молекулы ДНК.

Получение гена из природного генетического материала впер­вые осуществил Дж. Беквит в 1969 г. (Beckwith, Zipser, 1970), выде­лив гены лактозного оперона Е. coli. Главную роль в этом методе играли ферменты рестрикции (разрезания ДНК) — рестриктазы. Рестриктазы синтезируются практически всеми бактериями. Они относятся к группе ферментов-эндонуклеаз, которые делают разрезы в молекуле ДНК. Разные рестриктазы всегда разрезают ДНК в определенных местах — сай­тах рестрикции, которые они способны узнавать. Собственная ДНК организма, продуцирующего рестриктазу, обычно модифици­рована по участку узнавания, чтобы предотвратить саморасщепле­ние. Модификация осуществляется посредством включения в ДНК бактерии модифицированных азотистых оснований благодаря осо­бой ферментативной системе модификации. Ферменты рестрикции и модификации представляют собой единую систему. Эта система является своеобразным барьером, предохраняющим клетку от про­никновения чужеродного генетического материала, и включения его и собственный геном. Структура многих сайгой рестрикции-моди­фикации в настоящее время расшифрована.

Ферменты бактериальной клетки могут модифицировать ДНК внедрившегося фага еще до того, как его атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приведет к лизису клетки, а все по­томство такого фага будет содержать также модифицированную ДНК. Оно будет способно заражать другие бактерии с такой же сис­темой репарации.

К 1977 г. А. Максамом, У. Гилбертом, Ф. Сэнджером (Gilbert, 1981; Sanger, 1981) были разработаны специальные методы опреде­ления нуклеотидных последовательностей ДНК, которые получили название секвенирование (от англ. sequence — последователь­ность). Все методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы. Разработаны разные методические подходы секвенирования и спо­собы выделения набора фрагментов. Хотя поиск нужного гена среди смеси рестрикционных фрагмен­тов представляет определенные сложности и является трудоемким процессом, этот подход стал основным в генной инженерии.

• Синтез генов путем обратной транскрипции.

       Если известна хотя бы часть первичной структуры нужного бел­ка, то можно синтезировать коллинеарную часть соответствующего гена. Такие участки получили название ДНК-зонды. Их применя­ют для поиска комплементарной м-РНК. Выделенную с помощью зонда м-РНК можно использовать для синтеза комплементарной ДНК (к-ДНК) путем обратной транскрипции. После синтеза одной цепи с помощью ДНК-полимеразы можно синтезировать вторую цепь.

Большим недостатком этого метода является отсутствие в син­тезированных генах регуляторных элементов, необходимых для экспрессии. К тому же часто к-ДНК является упрощенной копией гена, поскольку содержит только его кодирующую часть, т. е. экзоны (без интронов).

2.8.  Принципы конструирования рекомбинантных  ДНК и их  введение в реципиентные клетки.

2.8.1. Создание рекомбинантной ДНК

Для переноса необходимого генетического материала используются особые структуры, способные переносить чужеродную ДНК в клетку-реципиент, — векторы. В генной инженерии векторы по­лучили название «молекулярное такси». В качестве векторов могут быть использованы два вида структур, содержащих ДНК,— плазмиды и вирусы. ДНК вектора разрезают теми же рестриктазами, кото­рые использовались для экзогенной ДНК.

Рестриктазы, обычно используемые в генной инженерии, разре­зают обе цепи ДНК в симметричных точках палиндромов — ко­ротких участков ДНК, в которых запись нуклеотидов слева направо в одной цепи аналогична записи справа налево в другой цепи. Так, первая рестриктаза, которая нашла широкое применение, — EcoRl, узнает последовательность GAATTC. Участок цепи ДНК она всегда разрывает между точками G и А:

5′ -GAATTC

3′ –CTTAAG

Поэтому фрагменты ДНК, полученные при помощи этой рест­риктазы, всегда несут на своих концах одноцепочечные участки ААТТ и ТТАА, комплементарные друг другу. Такие участки получи­ли название «липкие концы», поскольку они позволяют любые фрагменты ДНК, полученные при помощи одной рестриктазы, соеди­нять друг с другом. Это свойство и используется для соединения по­лученной ДНК и ДНК вектора.

Каждая рестриктаза узнает свою специфичную последователь­ность. Некоторые рестриктазы дают «липкие концы», другие — «тупые концы», воздействуя на связи, расположенные точно друг напротив друга. «Тупые концы» можно превратить в «липкие», присоединив искусственно синтезированные последовательности, узнаваемые определенной рестриктазой, — линкеры. Они позволя­ют клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотно­сительно к специфичности сайтов рестрикции. Иногда к «тупым концам»   присоединяют  (при  помощи  фермента   терминальной трансферазы) комплементарные «хвос-ты» — поли (А) и поли (Т).

     2.8.2.  Введение рекомбинантной ДНК в клетку

Как уже говорилось ранее, в генной инженерии используются два вида векторов. К настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов.

• Векторы-плазмиды

Плазмиды являются основным материалом векторов. Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему конт­роля репликации, которая поддерживает их количество в бакте­риальной клетке на определенном уровне. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.

Единственные известные в природе эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. В генной инженерии были «сконструиро­ваны» особые плазмиды, способные существовать как в клетках Е. coli, так и в 5. cerevisiae. В этом случае один и тот же вектор может быть использован с двумя хозяевами.

• Векторы-вирусы

Явление переноса генетической информации при помощи вирусов называется трансдукцией и встречается в природе.

В генной инженерии наиболее широко применяется фаг λ. ДНК фага представляет собой линейную молекулу, поэтому один разрыв рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов. Эти фрагменты сшивают с чужеродной ДНК, в результате чего образуется химерный фаг. Этот фаг должен пройти цикл литической инфекции дли накопления достаточного количества встроенной ДНК.

Размер встраиваемой ДНК не должен превышать 10 % генома фага, иначе он не поместится в капсид. Для решения этой проблемы у фага-вектора удаляют часть собственной ДНК, оставляя только необходимые гены.

В последние годы разработаны методы введения экзогенной ДНК в клетки-реципиенты при помощи микрошприца.

• Экспрессия чужеродной ДНК

Экспрессия  генов— активизация транскрипции  гена, в процессе которой на ДНК образуется м-РНК.

Экспрессия чужеродного генетического материала в клетке-ре­ципиенте представлялась наиболее трудной задачей на заре станов­ления генной инженерии.

Накопление необходимого количества ДНК при использовании как вирусных, так и плазмидных векторов происходит в бакте­риальной клетке-хозяине. Обычно эукариотические гены в бакте­риальной клетке не экспрессируются. Для преодоления этого барье­ра разработаны различные подходы.

Для транскрипции эукариотического гена в бактериальной клетке он должен быть помещен под контроль бактериального про­мотора. Это достигается встраиванием либо кодирующей последо­вательности эукариотического гена в структуру оперона (причем рядом с промотором), либо бактериального промотора в вектор.

Для трансляции синтезированной чужеродной м-РНК были сконструированы векторы, в которых сайт рестрикции находится рядом с участком связывания рибосомы (за промотором), а вставка начинается с кодона АУГ.

При трансформации эукариот посредством ДНК бактерий необ­ходимо учитывать, что репликаторы бактериальной клетки в эукариотической клетке не работают. Для преодоления этого барьера вве­денная ДНК должна быть интегрирована с хромосомой, что значи­тельно легче осуществить у микроорганизмов. Хорошую модель такого «генно-инженерного» процесса мы можем наблюдать в при­роде. Было показано, что причиной опухолей некоторых растений является бактериальная Ti-плазмида длиной около 200 000 п. н. Эти  плазмиды проникают в клетки растений, часть ДНК Ti-плазмиды (Т-ДНК) встраивается в хромосомы растений и вызывает образова­ние опухолей, нарушая баланс фитогормонов. С помощью Ti-плазмиды были проведены различные эксперименты на растениях. В настоящее время многие барьеры, некогда препятствующие про­ведению первых исследований, в результате сложных манипуляций Преодолены. В бактериальном геноме экспрессируются введенные гены человека (инсулина, интерферона, гормона роста и др.). Генная Инженерия породила целую новую индустрию — биотехнологию.

1.  Строение и функции рибонуклеиновой  кислоты.

    3.1.  Строение и функции РНК.

Рибонуклеиновая кислота имеет много общего со структурой ДНК, но  отличается от неё рядом признаков:

1. Углеводом РНК является рибоза;
2. В состав РНК входят азотистые основания : А,Г, Ц, У.
3. РНК — одноцепочечная молекула;
4. Правило Чаргаффа может не выполняться.

 В  клетках  имеется  РНК  нескольких видов:

а)  м-РНК —и-РНК или мессенджер РНК:

• выполняют функцию матриц белкового синтеза;
• нуклеотидов от нескольких сот  до 10 000;
• незамкнутая цепочка нуклеотидов.

            б)  гя-РНК — гетерогенная ядерная РНК :

• которая является точной копией ДНК,
• в результате процессинга превращается в м-РНК;
• значительно  длиннее  м-РНК.

в)  т-РНК — транспортная РНК:

             г) мя-РНК –малая ядерная РНК принимает участие в процессе преобразования гя-РНК.

             д) РНК-праймер – крошечная РНК:

• Содержит около 10 нуклеотидов;
• Участвует в процессе репликации  ДНК.

е)  р-РНК –рибосомная:

• Входит в состав рибосом;
• Принимает непосредственное участие в синтезе полипептидной цепи;
• Составляет 85% всей РНК;

     В 1970 г.Альтман и Чек показали, что РНК может выступать и в роли катализатора в ряде клеточных процессов. Эта способность РНК позволила использовать эту молекулу для различных биотехнологических целей, в частности для борьбы с вирусными инфекциями.

Молекулы всех видов РНК имеют 4 основных плеча:

1.   Акцепторное плечо заканчивается последовательностью ЦЦА (5′-3′).

     Через 3′ происходит связывание с карбоксильной   группой аминокислоты.

2.   2 и 3 плечи состоят из стеблей, образованных комплементарными парами

     ос­нований    и петель из неспаренных оснований.

4.   Антикодоновое плечо узнаёт нуклеотидный триплет.

4. ДНК – носитель наследственной  информации.

         4.1. ДНК- строение молекулы и её виды.

Дезоксирибонуклеиновая кислота — биологическая макромолекула, носитель генетической информации во всех эукариотических и прокариотических клетках и во многих вирусах.

Структура ДНК:

• полимер,
• структурной единицей которого является нуклеотид,
• нуклеотид состоит из азотистого основания ( пуринового — А,Г; пиримидинового — Т, Ц); углевода дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты (НРОз^2-);
• двойная цепь правосторонняя,
• 10 пар основа­ний составляют полный оборот 360°,
• фосфатные группировки находятся снаружи спиралей,
• основания — внутри и расположены с интервалом 34 нм.
• цепи удерживаются вместе водород­ными связями между основаниями.

Рис. Вторичная структура ДНК.

 Рис. Первичная структура ДНК.

В разработке структуры молекулы ДНК важную роль сыграли наблюдения Чаргаффа(1949).

Правила Чаргаффа:

1.  А=Т, Г=Ц или А+Г/Ц+Т=1 пропорция пуриновых и пиримидиновых оснований всегда равная.

2.  для характеристики нуклеотидного состава ДНК был предложен коэффициент специфичности, учитывающий долю гуанин — цитозиновых пар: Г+Ц/А+Т или [ Г+Ц/ А+Т+Г+Ц ] х 100%.

    Нуклеотиды соединены в полинуклеотидную цепь связями между 5′ положения одного пентозного коль-ца и  положения 3′ следующего пентозного кольца через фосфатную группу с образованием фосфодиэфирных мостиков, т.е. сахарно-фосфатный остов ДНК состоит из 5′-3′  связей. Генетическая информация записана в последовательности нуклеотидов в направлении от 5′ конца к 3′ концу — такая цепь называется смысловой ДНК, здесь расположены гены.

Вторая цепь направления 3′- 5′ считается антисмысловой, но является необходимым «эталоном» хранения генетической информации. Она играет большую роль в процессах реп­ликации и репарации (восстановлении структуры повреждённой ДНК).

В настоящее время описаны несколько модификаций молекул ДНК.

Полиморфизм ДНК — способность молекулы принимать различные конфигурации. В настоящее время описано 6 форм, часть которых может существовать только в пробир­ке:

В- форма — имеет стандартную структуру, соответствующую модели ДНК Уотсона и Крика, в физиологических условиях ( низкой концентрации солей, высокой степени гидратации) является доминирующим структурным типом.

А-форма — обнаружена в более обезвоженных средах и при более высоком содержании ионов калия и натрия. Её информация близка к структуре двухцепочечных ДНК.

С-форма — имеет меньше форм оснований на виток, чем В-форма. В этих трёх формах могут находиться все ДНК независимо от нуклеотидной последовательности.

Д и Е-формы — имеют наименьшее число оснований на виток (7,5-8). Обнаружены только в молекулах ДНК, не содержащих гуанина.

Z-форма — зигзагообразная форма, с чередованием лево- и правоспиральности. Эта форма выявляется при наличии ряда факторов:

1.   Высокая концентрация солей и наличие специфических катионов;

2.  Высокое содержание отрицательных супервитков в молекуле ДНК встре­чается на участках, обогащенных парами Г-Ц;

Некоторые из форм могут при определённых условиях, связанных с изменениями концентрации солей и степени гидратации, переходить друг в друга: А↔ В; Z↔B. Взаимные переходы А и В — форм регулируют работу генов.

Знания структуры и функции ДНК необходимо для понимания сути некоторых гене­тических процессов, которые являются матричными. Сама ДНК не может играть роль матри­цы   при синтезе белков из аминокислот, т.к. вся находится в хромосомах, а они в ядре, в то

время как все клеточные белки синтезируются в цитоплазме. Таким образом, генетическая информация, заключённая в ДНК, должна передаваться какой-то промежуточной молекуле, которая транспортировалась бы в цитоплазму и участвовала в синтезе полипептидных це­пей. Такой промежуточной молекулой может быть РНК. Это было подтверждено тем, что клетки, синтезирующие большое количество белка, содержат много РНК. Взаимоотношения ДНК и РНК были представлены в виде схемы:

  Такой  путь  передачи  информации  от  ДНК  к и-РНК  и  белку Ф. Крик назвал «Центральной догмой молекулярной биологии» . считалось, что передача генетической информации в обратном направлении  невозможна.  В  1975г. Р.Дульбеко, Г.Тимин, Д. Балтимор описали явление обратной транскрипции, т.е. передачу информации  с  и-РНК  на ДНК с помощью  фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

  4.2.  Генетический код.

Единая система записи  наследственной  информации  в  молекулах  нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов.
20 аминокислот.

4 вида нуклеотидов.

В связи с этим, чтобы закодировать 20 аминокислот,то нужно выбрать триплетный код, т.к. двуплетный может зокодировать только 16 аминокислот, а не 20.

Из 64 кодонов три кодона УАГ, УАА, УГА не кодируют аминокислоты и были назва­ны нонсенс-кодонами или терминирующими т.к. прекращают синтез веществ (белка).

Секвенирование — метод позволяющий определять нуклеотидную последовательность ДНК и РНК.

Свойства генетического кода.

1. Генетический код триплетен.
2. Вырожденность — обусловлена тем, что одна аминокислота может кодироваться несколькими триплетами ( исключение — метионин, триптофан), триплет АУГ — метионин, вы­полняет функцию инициирования (возбуждения) считывания и не кодирует А_к,если стоит в начале цепи ДНК.
3. Однозначность — каждому кодону соответствует одна А_к.
4. Генетический код не перекрываем — процесс считывания не допускает возмож­ности перекрывания кодонов, оно идёт без пропусков вплоть до нонсенс-кодонов.
5. Генетический код универсален, — т.е. вся информация в ядерных генах всех ор­ганизмов кодируется одинаково.

• Однонаправленность  считывания (5’→3′). 
• В универсальном генетическом коде 61 кодон кодирует 20 ами­нокислот. Три кодона не соответствуют никакой аминокислоте и определяют момент окончания синтеза полипептида. Это так назы­ваемые терминирующие кодоны (стоп-кодоны, нонсенс-кодоны) — УАА, УАГ, УГА. Они выполняют роль знаков препинания между генами. Соот­ветствие структуры гена (в нуклеотидах) и структуры кодируемого им белка (в аминокислотах) получило название коллинеарности.

        Для считывания информации положение первого основания кодона определяет рамка считывания. Число возможных рамок считывания равно трём, т.к. код триплетен. Обычно функциональный белок синтезируется по одной рамке считывания, связанные с вы­падением или добавлением одного или нескольких нуклеотидов. Это называется мутацией со сдвигом рамки.

4.3.  Репликация ДНК — удвоение, происходит в синтетическую (S) стадию интерфа­зы перед каждым делением клетки. В 1957 г. Дельбрук и Стент сформулировали три альтернативные гипотезы репли­кации ДНК в клетках эукариот:

1. консервативная репликация -исходная двухцепочечная молекула ДНК, служит матрицей для образования совершенно новой двухцепочечной молекулы, на цело достраивающейся на  исходной. Одна из дочерних клеток получит исходную ДНК, а дру­гая вновь синтезированную.
2. полуконсервативная репликация -две нити ДНК расплетаются ( как за­стёжка- молния), Каждая цепь служит матрицей для образования новой. ДНК постепенно разделяется специальным ферментом на 2 половины в продольном направлении. Каждая половинная спираль снова становится целой и вместо 1 молекулы полу­чается две. Хромосома становится двухроматидной.
3. дисперсионная репликация — исходная ДНК распадается на короткие разной длины фрагменты, используемые в качестве матриц для построения фрагментов 2-х новых двойных спиралей, которые затем воссоздаются в единую структуру молекулы. Образованные молекулы ДНК содержат старые и новые фрагменты.

   В 1955 г. Корнберг и его коллеги открыли фермент, который обеспечивает реп­ликацию ДНК, и назвали полимеразой. На современном этапе среди ферментов, участ­вующих в синтезе ДНК, выделены:

1. ДНК-полимераза 1.2.3.     обладают 5′->3′ полимеразной активностью.
2. Топоизомвразы — ферменты, катализирующие переходы в молекулах ДНК, свя­занные с изменением степени сверхспирализации.
3. ДНК-гиразы — переводят двухцепочечную ДНК в состояние отрицательной сверхспирализации.

 Рис.  Этапы вырезания и репарации поврежденного участка

ДНК (Айала, 1988).

4.4. Репарация ДНК — «залечивание» повреждений ДНК. Включает три этапа:

1. изменённый участок повреждённой цепи ДНК распознаётся и удаляется с помощью ДНК — репарирующих нуклеаз. В спирали ДНК образуется брешь.
2. ДНК-полимераза и гликозйлазы заполняют эту брешь, присоединяя нуклеотиды;
3. ДНК-лигазы «сшивает» разрывы и завершает восстановление молекулы.

  4.5.   Биосинтез белка.

Все био­химические процессы клетки можно разделить на ступенчатые и матричные. Ступенчатые процессы — это обмен низкомолекуляр­ных соединений, матричные — это синтез макромолекул (белков и нуклеиновых кислот). Активность генов непосредственно связана с матричными процессами. В процессе репликации происходит вос­произведение генетического материала. Реализация генетической информации — экспрессия генов — выражается в процессах транскрипции и трансляции.

4.5.1. Транскрипция (переписывание) — синтез на ДНК — матрице м-РНК,  осуще­ствляется на смысловой нити ДНК, находящейся в релаксированном (деспирализованном) состоянии.

   Синтез м-РНК имеет стадии:

1. инициация — для этого необходимо наличие специального участка ДНК-промотора. РНК-по-лимераза  связывает  с промотором, происходит локальное  расплетание двойной спирали ДНК, и образуется открытый промоторный участок.
2. элонгация (удлинение) цепи РНК — стадия транскрипции, которая  наступа­ет  после присоединения  8 рибонуклеотидов. Движующаяся  вдоль цепи  ДНК  РНК — полимераза  действует подобно застежки-молнии, раскрывая двойную спираль, которая смыкается позади фермента, после того, как основания РНК спариваются с основаниями ДНК.
3. терминация  {прекращение роста)  цепи  м-РНК  происходит  на  специфиче­ских участках ДНК, называемых терминаторами.

Процесс формирования зрелых молекул РНК из предшественников называется процессингом.

Сплайсинг — удаление последовательностей РНК, соответствующих тем участкам ДНК, которые не участвуют в кодировании полипептидной цепи.

Если у прокариот процессы транскрипции и трансляции идут практически одновременно, то у эукариот эти этапы разделены во времени.

Экспрессия гена (реализация генетического материала)у эукариот представляет собой сложный и мно­гоступенчатый процесс.

При экспрессии генов, кодирующих структуру белка, в результа­те процесса транскрипции, который заканчивается в зоне термина­ции, образуется гетерогенная ядерная РНК (гя-РНК). Она копи­рует всю нуклеотидную последовательность ДНК от промотора до терминатора, включая нетранслируемые области (рис.).

После этого гя-РНК претерпевает процессинг, или процесс об­разования функционально активных м-РНК. Он включает в себя процесс вырезания интронов и соединение экзонов — сплайсинг, процесс присоединения 7-метил-ГТФ к 5′ -концу гя-РНК с образованием «кэпа» («шапочки») — кэпирование и процесс присоеди­нения полиаденилового участка (поли-А) размером в 100—250 нук­леотидов к 3′-концу — полиаденилирование. В результате процессинга образуется м-РНК (рис.).

Обычно гя-РНК в несколько раз (иногда в десятки раз) больше м-РНК.   Если   гя-РНК   составляет  примерно  10 %   генома,  то м-PHK — только 1-2 %. Предполагается, что функция «кэпа» связана с инициацией про­цесса трансляции в результате прикрепления лидирующего участка м-PHK к определенному участку рибосомы, а полиадениловый «хвост»  защищает м-РНК от ферментативного разрушения  во  время транспортировки к рибосомам. Точность сплайсинга регулируют мя-РНК, которые имеют участки, комплементарные концам нтронов. У прокариот и-РНК образуется в результате транскрипции, и процессинга этот вид РНК не претерпевает.

            4.5.2.Трансляция (перевод)-процесс воплощения генетической информации м-РНК в структуру полипептида. Зрелая м-РНК выходит в цитоплазму, где и осуществляет­ся процесс трансляции. Процесс декодирования осуществляется в направлении от 5’—>3′ и происходит в рибосомах. Комплекс м-РНК и рибосом называется полисомой.

Все рибосомы состоят из двух субъединиц — большой и малой. Размер рибосом и их субъединиц выражается скоростью седимента­ции частиц в растворе (5 — константа Сведберга). Рибосомы про­кариот характеризуются значениями 70S (30S + 50S), эукариот — .SOS (40S + 60S). Рибосомы хлоропластов и митохондрий похожи на рибосомы прокариот. Рибосомы содержат два участка — А (аминоацильный) и Р (пептидильный), являющиеся основными ката­литическими центрами. Помимо них, имеются и другие центры связывания ферментов. Специфичность участков определяется сочетанием соответствующих областей обеих субъединиц. При диссоциации субъединиц их специфичность теряется (рис.).

Рибосомы имеют в своем составе 4 вида р-РНК. Три из них образу­ется из единого предшественника (45S-PHK), синтез которого происходит в специализированной  ядерной структуре — ядрышке — при помощи РНК-полимеразы-1. В ядрышке концентрируются петли хромосом, содержащие гены р-РНК. Эти гены обычно имеют много копий. Так, у человека 200 копий генов р-РНК располагаются на концах 5 пар хромосом (т. е. они имеются на 10 хромосомах из 46), поэтому сразу после митоза можно видеть 10 маленьких ядрышек, которые быстро сли­ваются в одно большое.

В процессе трансляции выделяют следующие стадии:

1. Стадия активации аминокислот. Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи особых ферментов (аминоацил-т-РНК-синтетаз) в присутствии  АТФ. Для  каждой аминокислотысуществует  свой  фермент  и  своя РНК.  Активированная аминокислота присоединяется к своей т-РНК с обра­зованием комплекса аминоацил-т-РНК (аа-т-РНК). Только акти­вированные аминокислоты способны образовывать пептидные свя­зи и формировать полипептидные цепочки.

3. Элонгация. Начинается с присоединения в А-участок и-РНК второго комплекса аа-т-РНК с антикодоном, комплементарным сле­дующему кодону и-РНК. В рибосоме оказываются две аминокисло­ты, между которыми возникает пептидная связь. Первая т-РНК осво­бождается от аминокислоты и покидает рибосому. Рибосома переме­щается вдоль нити и-РНК на один триплет (в направлении 5′ → 3′). 2-я аа-т-РНК перемещается в Р-участок, освобождая А-участок, ко­торый занимает следующая 3-я аа-т-РНК. Таким же образом присоединяются 4-я, 5-я и т. д. аминокислоты, принесенные своими т-РНК.

4. Терминация. Завершение синтеза полипептидной цепочки. Наступает тогда, когда рибосома дойдет до одного из терминирую­щих кодонов УАГ, УАА, УГА.

Имеются особые белки (факторы терминации), кото­рые узнают эти участки.

Процесс биосинтеза белка проходит с участием большего коли­чества специфических биохимических взаимодействий. Он пред­ставляет собой фундаментальный процесс природы. Несмотря на чрезвычайную сложность (особенно в клетках эукариот), синтез одной молекулы белка длится всего 3—4 секунды.

Регуляция экспрессии у эукариот

Многоклеточные эукариотические организмы имеют разнообраз­ные дифференцированные клетки. Хотя во всех клетках содержатся одинаковые гены, экспрессируются они не одинаково. Для эукариот характерна дифференциальная экспрессия генов в разных клетках ор­ганизма. У эукариот транскрипция гена еще не означает его экспрес­сии в фенотипе. Механизм их системы регуляции экспрессии связан с особенностями функционирования эукариотического генома.

У эукариот опероны не обнаружены. Гены, контролирующие один метаболический путь, у эукариот часто разбросаны по всему интрону. Сравнение размеров м-РНК и кодируемого ими полипепти­да показывает, что большинство (если не все) м-РНК эукариот — моноцистронные. Хотя и у прокариот, и у эукариот функционируют системы регуляторных белков, наличие многоступенчатой экспрес­сии и нуклеосомная организация хроматина эукариот дают намного больше возможностей для регуляции.

Многоступенчатый характер экспрессии генов эукариот позво­ляет осуществлять регуляцию на всех этапах. Можно выделить сле­дующие «контрольные точки» регуляции.

•  Контроль на уровне транскрипции. Основным уровнем ре­гуляции у эукариот является регуляция на уровне транскрипции.  Помимо участия регуляторных генов, регуляция транскрипцииу эукариот может осуществляться конденсацией-деконденсацией хроматина. Хорошо известно, что при активации генетического ма­териала он деконденсируется. Это достигается различными путями, на которых мы сейчас останавливаться не будем. С другой стороны далеко не весь эухроматин транскрибируется. Поэтому имеются и дру­гие пути контроля транскрипции — на стадии инициации и, возможно, кэпирования, терминации.

На процессы «включения» и «выключения» генов, их конденса­ции и деконденсации ощутимое влияние оказывают различные хро­мосомные перестройки, МГЭ, изменяющие эффект положения гена.

Частным случаем регуляции на уровне транскрипции является гормональная регуляция, при которой гены «включаются» в ответ на внешний стимул.

• Контроль на уровне процессинга. На уровне процессинга в первую очередь необходимо отметить феномен альтернативного сплайсинга с другим порядком сшивки экзонов. Это позволяет на основе одной и той же нуклеотидной последовательности одного  гена формировать разные белки, состоящие из разных сочетаний одних и тех же аминокислотных блоков. Так проявляется принцип экономного использования генетигеской информации  эукариот в раз­ные периоды жизнедеятельности.

В ооцитах некоторых животных происходит накопление и-РНК, у которых не закончен процессинг. Такие РНК не транслируются. Окончание процессинга и последующая экспрессия наступают только после оплодотворения.

• Контроль на уровне транспортировки м-РНК. Примерно половина гя-РНК полностью распадается в ядре, не выходя за его пределы. Возможно, распаду подвержены такие транскрипты, кото­рые не способны превратиться в зрелую и-РНК.
• Контроль на уровне стабильности м-РНК. Избиратель­ная стабилизация определенных типов м-РНК в цитоплазме, кото­рые не подвергаются распаду после трансляции. Наглядным приме­ром дифференциальной стабильности м-РНК может служить син­тез белков глобинов на стабильных м-РНК безъядерных ретикулоцитов млекопитающих.
• Контроль на уровне трансляции. Отбор  определенных  м-РНК для трансляции на рибосомах. На уровне трансляции обна­ружена дифференциальная активность аа-т-РНК-синтетаз, влияние гормональной регуляции.
• Контроль на уровне посттрансляционной модификации белка. Посттрансляционная модификация полипептида и превраще­ние его в функционально активную молекулу белка завершает про­цесс реализации генетической информации. Она представляет сооой различные модификации определенных аминокислот (фосфорилирование, ацетилирование), удаление некоторых из них и формирова­ние на этой основе вторичной, третичной, четвертичной структуры белка. На посттрансляционном уровне также возможна регуляция экспрессии. Широко распространен механизм регуляции активности ферментов, основанный на присоединении молекул-эффекторов, в роли которых часто выступают конечные продукты биосинтеза.

Рассмотрение проблемы регуляции экспрессии генов приводит к во­просу о координации этой регуляции. Каким образом в каждой клетке происходит активация именно необходимой комбинации генов, определя­ющих ее фенотип? Для млекопитающих (в том числе и для человека) установлено наличие большого числа факторов регуляции надклеточного уровня, включая факторы нервной и эндокринной систем.

5.  Организация генома эукариот.

Генетический материал эукариот сконцентрирован в ядре и представлен хромосомами, в которых молекула ДНК образует сложный комплекс с различными белками.

        5.1. Хромосомы и кариотип

Каждая клетка любого организма содержит определенный на­бор хромосом. Совокупность хромосом клетки называется кариотипом. В кариотипе соматических клеток выделяются пары одина­ковых (по структуре, форме и генному составу) хромосом — так на­зываемые гомологичные хромосомы (1-я — материнская, 2-я — отцовская). Набор хромосом, содержащий пары гомологов, называ­ется диплоидным (обозначается 2n). Половые клетки — гаме­ты — содержат половину диплоидного набора, по одной хромосоме из каждой пары гомологов. Такой набор называется гаплоидным (обозначается n).

       5.2. Строение  и  типы  хромосом.

   Исследуется  кариотип на  стадии метафазы митоза, когда  хромосома состоит из двух идентичных хроматид и максимально  спирализована. Соединяются хроматиды в области центромеры (первичной перетяжки). В этой области располагается 1 фибриллярное тельце — кинетохор, к которому присоединяются нити  веретена деления во время митоза.

Участок хроматиды между центромерой и

обозначения: короткое — ри длин­ное — q. В зависимости от расположения центромеры разли-

чают следующие морфологические типы хромосом:

• метацентрические (р=q),
• субметацентрические (q > p),
• акроцентрические (одно­плечие — q).

Некоторые хромосомы кариотипа имеют вторичную перетяжку, где обычно располагается яд

рышковый организатор — область формирования ядрышка. В ядрышке происходит синтез р-РНК и образование субъединиц рибосом. В ядрах разных организмов име­ется от 1 до 10 ядрышек, у некоторых их нет совсем.

      Кариотип можно представить в виде схемы, в которой хромосомы располагают в определенном порядке (обычно по группам, объединяющим хромосомы одного морфологического типа), под определенными номерами. Такая схема называется идиограммой. Гомологичные хромосомы имеют одинаковый номер, но изображается  на  схеме  только одна из них.

Идиограмма — это систематизированный кариотип, в котором хромосомы располагаются по мере убыва­ния их величины. Точно расположить хромосомы по ве­личине удается далеко не всегда, так как некоторые пары хромосом имеют близкие размеры. Поэтому в 1960 г. была предложена Денверская классификация хромосом, ко­торая помимо размеров хромосом учитывает их форму, положение центромеры и наличие вторичных перетяжек и спутников. 23 пары хромосом человека разбили на 7 групп от А до G. Важным параметром является центромерный индекс (ЦИ), который отражает отношение (в %) длины короткого плеча к длине всей хромосомы.

К группе А относят 1—3 пары хромосом. Это боль­шие, метацентрические и субметацентрические хромосо­мы, их центромерный индекс от 38 до 49.

Группа В (4 и 5 пары). Это большие субметацентри­ческие хромосомы, ЦИ 24-30.

Группа С (6—12пары). Хромосомы среднего размера, субметацентрические, ЦИ 27-35. К этой группе относят и Х-хромосому.

Группа D (13-15 пары). Хромосомы акроцентрические, сильно отличаются от всех других хромосом челове­ка, ЦИ около 15.

Группа Е (16-18 пары). Относительно короткие, ме­тацентрические или субметацентрические, ЦИ 26-40.

Группа F (19-20 пары): две короткие, субметацент­рические хромосомы, ЦИ 36-46.

Группа G (21 и 22 пары): это маленькие акроцентрические хромосомы, ЦИ 13-33. К этой группе относят и Y-хромосому.

Кариотипы наиболее важных генетических объектов, таких как человек, лабораторные и сельскохозяйственные животные, стандартизированы (Paris Conference, 1971; Reading Conference, 1976). Стандарты предполагают закрепление определенного номера, груп­пы и схемы дифференциальной исчерченности для всех хромосом. Схемы исчерченности создаются для каждого метода окраски и уровня спирализации. Разработаны принципы нумерации каждой полосы хромосомы, обозначения различных хромосомных перестроек, а также характер изменения исчерченности в зависимости от уровня спирализации.

Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее четко. Например, Q-сегменты — это участки хромосом, флюорес­цирующие после окрашивания акрихин-ипритом; G-cerменты выявляются при окрашивании красителем Гимза (Q- и G-сегменты идентичны); R-сегменты окрашиваются после контролируемой тепловой де-натурации и т.д.. Дан­ные методы позволяют четко дифферен-цировать хромо­сомы человека внутри групп.

Короткое плечо хромосом обозначают латинской бук­вой р, а длинное — q. Каждое плечо хромосомы разделя­ют на районы, нумеруемые по порядку от центромеры к теломере. В некоторых коротких плечах выделяют один такой район, а в других (длинных) — до четырех. Поло­сы внутри районов нумеруются по порядку от центроме­ры. Если локализация гена точно известна, для ее обо­значения используют индекс полосы. Например, локали­зация гена, кодирующего эстеразу D, обозначается 13р14 — четвертая полоса первого района короткого плеча 13 хромосомы.

Структура хромосом

Каждая хроматида содержит одну молекулу ДНК, связанную с белками-гистонами и негистоновыми белками. В настоящее время принята нуклеосомная модель организации хроматина эукариот (Olins, Olins, 1974; Korenberg, 1974).

Согласно этой модели белки-гистоны формируют особые глобулы, по 8 молекул в каж­дой глобуле (по 2 молекулы гистонов Н2а, Н2б, НЗ, Н4). Нить ДНК делает по 2 витка вокруг каждой глобулы. Структура, состоящая из гистонового октамера, обвитого участком ДНК (размером 140— 160 п.н.), называется нуклеосомой. Такая укладка ДНК сокращает её  длину в 7 раз. Нуклеосомная модель получила название «бусинки на нитке». Положительно заряженные гистоныи отрицательно заря­женная ДНК образуют надежный ДНК-гистоновый комплекс.

Участок ДНК между нуклеосомами имеет гистон HI. Он играет илжную роль в спирализации нуклеосомной нити и образовании игорого уровня организации хромосом — винтообразной структуры соленоида. Последующая многоступенчатая укладка ДНК-гистоновой нити определяет компактную упаковку генетического материа­ла в хромосоме, так называемый процесс компактизации хрома­тина. Всего выделяют 4—5 уровней упаковки, начиная с нуклеосомного (рис.).

Степень компактизации хроматина различается в разных участ­ках хромосом и зависит от периода клеточного цикла. Определен­ную роль в этом процессе играют разнообразные негистоно-вые бел­ки. Благодаря процессу компактизации очень длинные молекулы ДНК упакованы в клетке в небольшом объеме. Например, ДНК хромосом человека общей длиной около 1,8м упакована в ядре диамет-ром менее 1 микрометра.

• правило постоянства числа хро-мосом;
• правило парности хромосом;
• правило индивидуальности хро-мосом;
• правило непрерывности хромосом.

5.3. Понятие  гетеро- и эухроматина.

Хроматин (вещество хромосом) у эукариот упакован неодинаково. Различают 2 типа хроматина:

• эухроматин (упакован менее плотно);
• гетерохроматин (упакован более плотно).

Гетерохроматин разделяют на два класса:

• структурный (или  конститутив-ный)  гетерохроматин (постоянно выявляемые участки);
• факультативный гетеро­хроматин (участки обратимой компактизации эухроматиновых районов). Структурный  гетерохроматин  локализован  в прицентромерных облас-тях  и  некоторых  других  районах хромосом, он хорошо выявля­ется С-окраской. В интерфазе участки структурного гетерохроматина  часто агрегируют друг с другом и образуют хромоцентры.

Считается, что гетерохроматин генетически неактивен в связи с высокой степенью конденсации, а эухроматин — активен. Но, с дру­гой стороны, только незначительная часть генов эухроматина ак­тивна, т. е. нахождение в эухроматине является недостаточным условием для экспрессии генов. Еще больше вопросов возникает при изучении функционирования гетерохроматина.

5.4. Половой хроматин.        

    Факультативный гетерохроматин выявляется не во всех клетках. Он представляет собой спирали-зированные Х-хромосомы. В женском организме, со­держащем в норме две Х-хромосомы, одна из них остается плотно упакованной, инактивированной и в интерфазных клетках проявляет свойство гетерохроматина. Если в организме имеет­ся только одна Х-хромосома, то факультативный хроматин в нем отсутствует. В норме он обнаружи­вается у женщин, а у мужчин его нет. Причина формирования факультативного гетерохроматина у человека установлена в 1961 году М. Лайон. Было доказано существование эволюционно сформировав­шегося механизма исключения из активной деятель­ности второй дозы генов, расположенных в Х-хромосоме. В результате, несмотря на отсутствие зна­чительного количества генетического материала из-за малых размеров Y-хромосомы, мужской и женский организм уравновешиваются по количеству функционирующих генов. Компенсация дозы генов сохраняется и в случаях аномально большого числа Х-хромосом в клетке, т.е. и в таких клетках деспирализованной остается лишь одна Х-хромосома.

Гетерохроматин У-хромосомы и факультативный называют половым хроматином. Его часто исполь­зуют для исследования половых хромосом. Число те­лец факультативного гетерохроматина всегда на одну единицу меньше количества Х-хромосом, а У-гетерохроматин указывает на наличие в этом организме У-хромосомы.

Весь другой хроматин клеточного ядра называ­ется эухроматином. Он состоит из деспирализованных нитей. Эухроматин содержит основную часть наследственной информации, определяющей призна­ки организма.

       5.5. Современные  методы цитологического анализа хромосом.

       Для цитогенетического анализа все хромосомы, входящие в ка­риотип, должны быть идентифицированы. Основной метод иденти­фикации хромосом на цитологических препаратах — это различные способы дифференциальной окраски (Q-, G-, R-, С- и др.), кото­рые основаны на применении определенных красителей, специфи­чески связывающихся с участками ДНК разного строения. Методы дифференциальной окраски были разработаны в конце 1960-х — начале 1970-х годов, они открыли новую страницу в цитогенетике (Захаров, 1977). Каждая дифференциально окрашенная хромосома имеет свой специфический рисунок исчерченности, что позволяет ее идентифицировать.

Существуют  и  другие  методы  исследования хромосом:

                    а.  Методы  экспресс-диагностики  пола – определение  Х-  и Y-  хроматина;

                    б.  Кариотипирование – определение  количества  и  качества  хромосом;

Рис.  Тельца Барра в эпителиальных клетках:

А — нормальной женщины;   В — мужчины; С — женщины с трисомиейпо Х-хромосоме.

При любом методе хромосомного анализа необ­ходимо исследовать не менее 11 клеток. Если учесть время, которое требуется для культивирования тка­ней, то изучение кариотипа одного человека обычно занимает 1-2 недели. Методы анализа полового хроматина позволяют оценить наличие и ко­личество половых хромосом у конкретного челове­ка, являются простыми в исполнении, требуют мало времени для получения результата (обычно — не более 1,5 часов). Выделяют три способа исследова­ния полового хроматина:

• анализ телец Барра,
• анализ «ба­рабанных палочек»,
• анализ  F-телец (рис.)

Тельце Барра — это факультативный гетерохроматин, выявляемый в эпителиальных клетках слизистой щеки. Для его исследования делают соскоб шпателем с внутренней поверхности обеих щек у че­ловека. Полученную суспензию наносят на предмет­ное стекло и окрашивают 2%-ным раствором ацетоорсеина. Исследуемый мазок накрывают покровным стеклом и оставляют на короткое время для окра­шивания. Анализ проводится с помощью светового микроскопа с использованием иммерсионного мас­ла, наносимого на покровное стекло. Тельце Барра определяется как небольшое, сильно окрашенное образование у стенки ядра эпителиальных клеток. В норме у женщин оно обнаруживается в 15-25%  исследованных клеток. У мужчин тельце Барра не должно определяться.

Факультативный гетерохроматин  выявляется и в сегментоядерных лейкоцитах крови, где он обра­зует выросты ядерной оболочки, напоминающие ба­рабанные палочки. Анализ наличия «барабанных палочек» проводится в мазках капиллярной крови, окрашенных обычным способом. В женском организме в норме регистрируется одна «барабанная па­лочка» на 500 сегментоядерных клеток.

Флуоресцентные красители позволяют обнару­жить гетерохроматин У-хромосомы. При таком спо­собе окраски мазка капиллярной крови выявляется интенсивное свечение длинного плеча этой хромосо­мы — F-тельце. Такое свечение сохраняется и в ин­терфазных клетках. У мужчин F-тельце должно об­наруживаться в 60-70% лимфоцитов крови, а в женском организме оно в норме отсутствует.

Современные методы анализа хромосом позволя­ют получить полноценную картину состояния кариотипа человека, выявить его изменения, определить причины многих патологических состояний и раз­работать меры их профилактики для конкретных семей.

 6. Типы  деления эукариотических клеток.

6.1. Клеточный цикл, его периоды.

Время существования клетки от деления до деления или смерти называют клеточным циклом. Во взрослом организме высших позвоночных, клетки различных тканей и органов имеют неодинаковую способность к делению:

A)  есть клетки, которые потеряли способность к делению (зернистые лейкоциты, эритроциты);

Б) есть клетки, которые постоянно обновляются (эпителиальные, кроветворные);

B)  есть клетки, которые начинают размножаться только после повреждения, обеспечивая регенерацию.

Размножающиеся клетки обладают разным количеством ДНК в зависимости от стадии клеточного цикла. Например, половые клетки содержат в 2 раза меньший набор хромосом, чем все остальные клетки. Единичный набор называется гаплоидным (In). Соматические клетки имеют диплоидный набор хромосом (2п). Соответственно и количество ДНК (с) на клетку: диплоидные клетки имеют 2с количества ДНК. При подготовке к делению ДНК удваивается и клетки становятся тетраплоидными (4п, 4с).

Весь клеточный цикл  состоит из 4 отрезков:

М — собственно митоза;

G₁ — пресинтетического;                 

S   —  синтетического;             интерфаза

G₂ — постсинтетического.

 В G₁— период идет рост клеток, увеличение белков, ДНК, синтез ферментов, необходимых предшественников ДНК, повышается активность ферментов, участвующих в энергетическом обмене.

  В S — период идет удвоение ДНК и числа хромосом (исключение второе деление созревания половых клеток в мейозе, когда между двумя делениями нет синтеза ДНК); удваиваются центромеры.

В G₂ период происходит синтез и-РНК, р-РНК рибосом, синтез белков тубулинов веретена деления. В конце периода, по мере конденсации хромосом, синтез РНК снижается и полностью прекращается во время митоза.

В растущих тканях всегда есть покоящиеся клетки, которые перестали размножаться, превращаются в камбиальные, стволовые клетки, которые теряют способность к дифференцировке, к специализации. Но при определенных условиях могут снова входить в цикл. Например, клетки печени после повреждения.

   Известно несколько способов  деления  клеток:

• митоз –непрямое деление клетки; Разновидностями митоза являются:
• эндомитоз- происходит удвоение хромосом без деления ядра, что способствует образованию полиплоидных клеток;
• политения-многократное удвоение хроматид и их нерасхождение, в результате образуются политенные  хромосомы;
• мейоз- деление соматических клеток половых желёз в результате образуются половые клетки (гаметы).
• амитоз— прямое деление клетки;

    6.2. Митоз и его  биологическое  значение.

Патология митоза.

Различные факторы внешней среды могут на­рушать процесс митоза и приводить к появлению аномальных клеток. Выделяют три типа наруше­ний митоза:

1. Изменение структуры хромосом. При этом возможно появление разрывов хромосом, наличие отдельных мелких хромосомных фрагментов. По­добная патология возникает под действием радиа­ции, некоторых химических веществ, вирусов, а так­же в раковых клетках. В некоторых случаях отдель­ные хромосомы могут отстать от других в анафазе и попасть не в свою клетку. Это приводит к изменению количества хромосом в дочерних клетках, т.е. к анеуплоидии.

• Повреждение веретена деления. Это нарушает  его функцию распределения хромосом между дочерними клетками. В результате возможно появление  клеток, содержащих значительный избыток хромосом (например, 92). Подобное действие характерно  для многих противоопухолевых препаратов. Таким  образом тормозится деление клеток опухолей.
• Нарушение цитотомии, т.е. отсутствие деления цитоплазмы клетки в периоде телофазы. Вслед­ствие этого образуются двуядерные клетки.

Патология митоза может приводить к появлению мозаицизма. В случае мозаицизма в одном организ­ме можно обнаружить клоны клеток с разным набо­ром хромосом (например, часть клеток у человека содержит 46 хромосом, в то время как другие — 47). Мозаицизм формируется на ранних стадиях дроб­ления зародышевых клеток.

6.3. Мейоз  и  его  биологическое значение.

Мейоз состоит из двух последовательных делений ядра, которые приводят к образованию половых кле­ток — гамет. Хотя во время мейоза клетка делится дважды, хромосомы удваиваются только один раз. В результате такого процесса обеспечивается редук­ция (уменьшение) числа хромосом в гамете вдвое по  сравнению с исходной клеткой, т.е. от диплоидного набора (46 у человека) — до гаплоидного (23 у чело­века). Тогда при слиянии двух половых клеток но­вый организм обретет вновь диплоидное число хро­мосом.

Значение мейоза заключается:

• во-первых, в том, что этот процесс обеспечивает постоянство числа хромосом в ряду поколений размножающихся по­ловым путем организмов. При данном типе размно­жения для формирования нового организма необхо­димо оплодотворение, т.е. слияние двух половых клеток. Если бы не происходило уменьшения (редук­ции) наследственного материала при образовании гамет, то число хромосом удваивалось бы в каждом поколении.
• Во-вторых, в процессе мейоза I в форми­рующихся клетках оказываются с равной вероятно­стью отцовские и материнские хромосомы от пред­ков организма, в котором происходит мейоз. Веро­ятность того, что в одной половой клетке человека окажутся только материнские или отцовские хромо­сомы, равна (¹/₂)²³, т.е. менее одной четырехмилли­онной. Таким образом, происходит перемешивание в потомстве генетической информации, полученной от предков. Подобное смешивание наследственных признаков прародителей усугубляется кроссинговером, так как в результате обмена участками между хроматидами число возможных комбинаций хромосом в гаметах становится практически бесконечно большим

Патология мейоза.

Как и митоз, процесс мейоза может нарушаться под влиянием различных внешних повреждающих факторов. Патология этого типа деления клеток обычно приводит к сбою в процессе распределения хромосом в гаметах. В зависимости от этого выде­ляют:

•  простое,
•  последовательное,
•  и двойное нерас­хождение.

При простом нерасхождении происходит непра­вильное распределение хромосом по клеткам либо в первом, либо во втором делении мейоза. Если затра­гивается мейоз I, то все зрелые гаметы будут иметь патологический набор хромосом (анеуплоидию). Па­тология мейоза II реализуется в изменение количе­ства хромосом только части гамет.

Последовательное нерасхождение затрагивает оба деления мейоза. В этом случае нормальные га­меты не образуются.

Крайне редко мейоз повреждается у обоих роди­телей. В этих случаях регистрируется двойное не­расхождение.

Кроме вышеописанных нарушений, можно выде­лить следующие виды нерасхождений хромосом:

•  первичное, которое происходит в мейозе у лю­дей с первоначально нормальным набором  хромосом;
•  вторичное, возникающее у человека, изна­чально имеющего патологический набор хро­мосом;
•  третичное, формирующееся в мейозе у людей, являющихся носителями сбалансированных перестроек хромосом.

Сбалансированные изменения хромосом не нару­шают состояние здоровья у человека, который имеет их в своем кариотипе. При мейозе этот баланс может не сохраниться. В такой ситуации гаметы получат аномальный набор хромосом.

6.4 и  6.5. Сперматогенез и овогенез.

Стадии спермато- и овогенеза.

   1-первичная половая клетка;

   2-перемещение первичной половой клетки в гонаду;

   3-сперматогония;

   4-митоз «диплоидной»  сперматогонии;

   5-сперматоцит  I-порядка;

   6-первое деление мейоза;

   7- сперматоцит  II-порядка;

   8-второе деление мейоза;

   9-сперматида;

  10-дифференцировка сперматид;

  11-зрелый сперматозоид;

Б-овогенез:

    1-первичная половая клетка;

    2-перемещение первичной половой клетки в гонаду;

   3-овогония;

   4-митоз «диплоидной»  овогонии;

   5-овоцит  I-порядка;

   6-первое деление мейоза  с  остановкой в профазе;

   7,8-созревание  овоцита  II-порядка;

   9-кортикальные гранулы;

  10-завершение мейоза-I;

  11- овоцит  II-порядка;

  12-первое полярное тельце;

  13-второе деление мейоза;

  14- зрелая яйцеклетка.

  15-второе полярное тельце;